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烟台品格林实验设备有限公司

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新闻详情

标准菌株的管理!(包含标准菌株的购置、验收、复活、确认、传代、储存、使用、废弃等)

标准菌株概念及其应用


1.1标准菌株概念

GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范食品微生物检测:

1、标准培养物:标准菌株、标准储备菌株和工作菌株的统称。

2、标准菌株:至少定义至属或种水平的菌株。按其特征进行分类和描述,有明确的来源。

3、标准储备菌株:标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。

4、工作菌株:由标准储备转接后获得的同种菌株。


1.2标准菌株的应用:

各种国际标准、国家标准、行业标准及企业标准等的相关微生物检测,用于验收培养基(包括试剂盒)、验证方法和评估实验操作。

微生物菌种管理的相关流程


2.1菌株的采集:

实验室用菌种一是到国家法定机构采购,二是购买ATCC菌种,三是科研中菌种交流。不管是哪种来源,均统一采集。采集中严格按照规范执行。要求包装可靠,采集迅速,不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。采集中要有菌种传代标识。选择有资质的标准菌株的合格供应商,每批标准菌株必须附带有供应商的合格证或检测报告或说明书,来证明所采购的标准菌株是合格的。


2.2标准菌株和验收:

实验室收到标准菌株,首先应进行符合性感官检查,记录菌株号和标准菌株来源途径信息,确保溯源性清楚。同时还应记录标准菌株名称和数量、生产日期、接收日期和有无破损等情况。


2.3冻干标准菌株的复活:

2..3.1开启产品包装:先用70%酒精棉擦拭外包装,从凹口处撕开产品外包装,撕掉标签上的拉片,将其贴于菌株接收、保存记录序号前面。


2.3.2复活:选择合适的培养基和培养条件(根据生产商说明或有关技术通则见附录)进行复活。菌种的首次活化最好是在非选择性琼脂培养基上,除非特殊情况或特别推荐,一般不用液体培养基。冻干菌株的传代次数不得超过5代,从标准菌株保藏中心购买的冻干标准菌株为第F0代。捏管帽处安瓿瓶(仅一次)使其释放水合液体。垂直握住安瓿瓶并轻拍之,使液体流入含小球的管底。通过挤捏压碎小球使其与液体混合,立即将拭子浸于水合液体。挤压并旋转拭子,接种于初级培养平板,接种圈的直径约为25mm,用一无菌接种环在先前接种区域划线10-20次,促使分离出单菌落。同时吸出部分菌液接种胰蛋白胨大豆肉汤管,副溶血性弧菌接种3%氯化钠菌胰蛋白胨大豆肉汤管。将接种好的平板和管立即进行培养。细菌培养温度通常为25℃或37℃。多数冻干菌株会在几天后长出,但是少数菌会表现出延滞期延长的现象,需要将正常培养时间加倍。复活后的菌株为F1代。


附录


2.3.3:将TSB生长的浓菌液吸0.5mL于菌株保藏管充分混匀后将液体吸出,将保藏管-18℃保存1-3年为标准储备菌株F2代。将平板上生长的良好菌株接种于营养琼脂斜面(副溶血性弧菌用3%氯化钠营养琼脂)36℃培养24h当作工作菌株,记录为F3代。


2.4工作菌株确认方法及依据:

用无菌接种环取上述培养物,在相应的培养基平板(营养琼脂、大豆胰蛋白胨琼脂)上或相应的细菌鉴别平板(如伊红美蓝、麦康凯、BP等上划线分离单个菌落,置适宜条件下培养(若该类微生物为厌氧菌,则培养条件应为厌氧条件)以同样方法取真菌和酵母菌至SDA(萨布罗培养基)平板上或玫瑰红钠培养基平板上,23~28℃下培养7d;培养后观察是否具有典型的菌落状态,然后挑取单一纯菌落,进行革兰染色、镜检,观察其染色特征及菌体形态以确定菌种。


2.5 污染处理:

假如在该平板上发现有其他菌落生长,则说明操作有污染或菌种不纯。要将该污染培养物做灭菌处理,寻找原因,重新分离挑选纯菌落。


2.6菌种保存:

所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐,详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况;每一种菌种一定要有检测鉴定报告(具体的的鉴定方法见ATCC提供的菌种证书方法);具体菌种保存方法一般为:

将复苏后肉汤与灭菌甘油按15%甘油比例(肉汤8.5mL+甘油1.5mL)混合,-30 ℃冻存,(可用2mL冻存管冻存多管),作为保藏储备菌株F1代,也可使用商品化的菌种保存管。


2.7菌种的传代:

2.7.1标准菌株的复苏:

① 菌种操作应在无菌条件下进行,防止杂菌污染。

② 每次使用和复苏时只需将小珠在平板上滚动或置肉汤中培养。


2.7.2标准储备菌株每转接一次须进行确认。(确认方法一般为他们各自独有的形态,在鉴别培养基上的形态)


2.7.3工作菌株转接的方法:

①配制营养琼脂培养基(溶血性弧菌加3%氯化钠 ),121℃高压灭菌15分钟后分装在试管内,冷却后备用。

②在无菌条件下,用接种环挑取菌苔至新鲜试管上作“米”字形划线接种,放置在36℃的培养箱内培养24小时。


2.7.4工作菌株的使用:

2.7.4.1内部质量控制:一个月一次阳性对照、培养基每批验收;

2.7.4.2外部质量控制:能力验证、实验室比对;


2.7.5工作菌株的期间核查:

2.7.5.1期间核查的频率:每半年对使用标准菌株进行一次期间核查。

2.7.5.2工作菌株期间核查的方法及依据:同工作菌株的确认一样。

2.7.5.3建立标准菌株期间核查记录。


2.8菌种的标识和使用期限:
2.8.1标识:菌种代数的计算为干粉菌种为第0代,转接一次加一代。

具体标识为:例单增李斯特氏菌第0代,标识为DZ-0,第一代标识为DZ-01第一代有12支,则DZ-01-01、……、DZ-01-12;并标明日期:如2017.02.13这样填写。


2.9 菌种的保藏:

2.9.1将试管内菌种放入冰箱中2~8℃冷藏保存。

2.9.2将传代并经过培养后的菌种放入冰箱中2~8℃保存。

每支保存菌种需标明菌名、标准编号、传次、传代日期。


2.10菌种的销毁:

2.10.1菌种使用后或超过贮存期的应进行销毁。

2.10.2需销毁的菌种,应用高压蒸汽(121℃)灭菌30分钟。

2.10.3灭菌后,再进行清洗和处理。

2.10.4销毁的菌种应做好记录。销毁时由化验负责人监督销毁,保管人员负责销毁。

实验室常用菌株保存方法


1.斜面低温保存法

将分纯的待存菌接种于适宜的固体斜面培养基上,得到充分生长后,用封口膜封口,贴上标签,保存于4℃的冰箱中。此法操作简单、使用方便、不需要特殊设备,是实验室菌种保存最常用的方法。但保存时间短,一般每个月都要移

种1次,而且菌种容易变异,所以此方法只适合实验室短期实验菌株的保存。


2.半固体琼脂法

用接种针将以分纯的待存菌,穿刺接种于半固体中,放入培养箱培养后出,封上无菌的液体石蜡,贴上标签,放4℃冰箱保存。此方法简便易操作,不需特殊设备、技术难度不大,但保存的时间不长,一般只能保存1年以内,而且对抵抗力弱以及一些特殊菌种大概只能存活3~6个月,需要频繁的传代,这样很容易使菌株受到污染、变异。所以此方法不适用菌种的长期保存,只适合实验室一些要求不高的菌种的短期保存。


3.液体石蜡保存法

将液体石蜡灭菌,放于37℃恒温箱中,使水汽蒸发掉备用。再将已分纯的待存菌在最适宜的斜面培养基中培养,使得到健壮的菌体,用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡,注入已长好的斜面培养基上,用量以高出斜面1cm为准,将试管直立,

贴上标签,置4℃下保存。此法制作简单,不需要特殊设备,菌种可以保存1年左右不需要经常移种,缺点是保存的时候需要直立放置。此方法适合实验室短期保存,而且保存时需要一定的空间。


4.高层半固体琼脂石蜡保存法

将待存菌经平板划线分离后,挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高固体琼脂培养基中,经培养箱培养后取出,用灭菌过的液体石蜡滴加到半固体琼菌种管表层约0.5cm高度,贴上标签,存放4℃冰箱。此法操作简便,不需要特殊设备,效果好,可以保存菌株1~2年。所以适合实验室菌株的较长期的保存。


5.纸片法

将已分纯的待存菌用无菌镊子镊取纸片,在纸片上刮取4~5个菌落,入冻存管内,盖上盖子后用封口胶布封住边缘,贴上标签,放入冰箱冷冻保存(-20℃左右)。此方法具有操作简单、不需特殊设备、经济实用、保存空间小等而且保存时间至少2年,但对一些营养要求比较高的菌种,存活率不理想。所以方法适合实验室一些营养要求不高的菌种较长时间的保存。


6.甘油液保存法

将已分纯的待存菌接种于肉汤中,37℃培养18~24h,然后按5份肉汤溶液、2份甘油-生理盐水保存液的比例分装于灭菌的微量离心管或细胞冻存管中,贴上标签,置-80℃~-20℃冰箱保存。此法操作简便,不需要特殊设备,效果好,可以保存菌种3年左右,无变异现象,而且此方法还可以保存一些要求较高的特殊菌种,适用范围广。所以此方法适合实验室普通菌种或特殊菌种的较长期的保存。


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